Математика	Физика	Химия	Биология	Техника и технологии
	Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии. Учеб. пособие для студентов биологических специальностей университетов. М., «Высшая школа», 1971. 352 с. с илл. Пособие представляет собой первое руководство такого рода на русском языке. Включает разделы: общие принципы препаративного получения ферментов и методы работы с ними; выделение, очистка и характеристика отдельных ферментов; ферменты как аналитические реагенты; препаративное получение отдельных субстратов и др. Основное внимание уделено методикам получения ферментов в высокоочищенном состоянии, способам характеристики активности ферментных препаратов и использованию ферментов в качестве аналитических реагентов. Последнее является важной, принципиально новой и весьма перспективной областью применения ферментов. Рассматриваются также методы получения некоторых биохимических препаратов, методы количественного определения различных соединений, хроматографические методы, гельфильтрация и др.
ПРЕДИСЛОВИЕ Одной из наиболее бурно развивающихся проблем современной биохимии является проблема биологического катализа и в частности — изучение химического и физического строения ферментов и механизма их действия. Изучение ферментов — их строения, механизма действия и т. д. — предполагает наличие высокоочищенных ферментных препаратов. Всякая энзимоло-гическая работа должна начинаться с выделения и очистки изучаемого фермента, освоения методов оп-. ределения активности, подбора условий для определения истинной скорости реакции. Именно этим вопросам уделяется главное внимание в предлагаемом руководстве. Основным критерием при подборе методик выделения и очистки ферментов и определения активности являлась достаточная их воспроизводимость в условиях практикума. Учитывалась также доступность реактивов, источников исходного материала и оборудования, которые требуются для проведения работы, а также имелось в виду включить основные современные методы очистки ферментов. В специальный раздел выделено использование ферментов в качестве аналитических реагентов. Их применение для количественного определения ряда веществ, а также в качестве сопрягающих агентов—при измерении активности других ферментов, является весьма перспективным. Эти методы не только более быстрые, точные и специфические, чем большинство применявшихся до сих пор, но в ряде случаев — единственно возможные. К сожалению, внимание, уделяемое им в настоящее время, далеко от того, которое они заслуживают. Чтобы студент не механически выполнял ту или .иную задачу, а имел определенное представление о том объекте или о том методе, с которым он работает, определенное место в руководстве уделено теоретическим предпосылкам. Настоящее практическое руководство предназначается для студентов, проходящих практикум по энзимологии. Кроме того, оно может быть использовано при прохождении отдельных разделов большого практикума по биохимии, а также в экспериментальной работе студентами-дипломниками, аспирантами и научными сотрудниками, работающими в области энзимологии. За просмотр рукописи и ценные замечания автор выражает 'признательность сотрудникам кафедры биохимии животных биолого-почвенного факультета МГУ, а также проф. И. П. Ашмарину и В. А. Яковлеву и доц. С. Н. Лызловой. Все критические замечания будут приняты автором с благодарностью. Г. Кочетов СОДЕРЖАНИЕ Предисловие........................ 3 Раздел I. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ПРЕПАРАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ И МЕТОДЫ РАБОТЫ С НИМИ Важность получения ферментов в чистом виде........ 5 Основные принципы работы с ферментами.......... 6 Методы очистки, хранение и определение чистоты ферментных препаратов......................... 11 О'бщие представления................. 11 Методы очистки ферментов............... 12 Экстракция . ,.................. 13 Кислотная обработка............... 14 Термическая обработка.............. 15 Фракционирование солями ............. 15 Фракционирование органическими растворителями . . 18 Фракционирование с помощью ионов тяжелых металлов 23 Метод избирательной адсорбции.......... 23 Ионообменная хроматография........... 26 Гель-фильтрация.......».......... 36 Кристаллизация . д............... 48 Критерий чистоты препаратов ферментов ........ 49 Хранение ферментов................. 52 Исследование активности ферментных препаратов и способы ее выражения......,................ 52 Измерение скорости ферментативной реакции...... 52 Методы определения ферментативной активности .... 54 Манометрические методы........... 54 Метод непрерывного титрования........ 55 Спектрофотометрические методы........ 55 Химические методы ... ......... 59 Выражение активности фермента........... 60 Раздел II. ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ СКОРОСТЬ ЭНЗИМАТИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ Концентрация фермента.........<. ,......... 63 Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции ....... ....... .......... . 63 Скорость энзиматической реакции при разных температурах 65 Оптимум рН ферментативных реакций..........•. • 67 Раздел III. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ Глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназа (D-тлюкозо-б-фосфат: НАДФ — оксидоредуктаза, 1.1.1.49) .......... 69 Выделение и очистка глюкозо-6-фосфат—дегидрогеназы из пивных дрожжей и определение ее активности .... 71 Ч4Я Выделение и очистка глюкозо-6-фосфат—дегидрогеназы из пекарских дрожжей и определение ее активности ... 75 Свойства глкжозо-б-фосфат—^дегидрогеназы, выделенной из дрожжей.................. 78 Фосфоглюконатдегидрогеназа (декарбоксилирующая), [6-фос-фоглюконат: НАДФ — оксидоредуктаза (декарбоксилирующая), 1.1.1.44]..................... 79 Выделение и очистка фосфоглюконатдегидрогеназы из пивных дрожжей и определение ее активности...... 80 Свойства фосфоглюконатдегидрогеназы, выделенной из пивных дрожжей................... 83 Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (D-глицеральдегид-З-фос-фат: НАД — оксидоредуктаза (фосфорилирующая), 1.2.1.12).....,......................... 84 Фосфоглюконатдегидрогеназа (декарбоксилирующая), [6-фос-фатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика и определение ее активности................ 87 Свойства глицеральдегадфосфатдегидрогеназы, выделенной из скелетных мышц кролика........... 92 Выделение, очистка и кристаллизация глицеральдегидфос-фатдегидрогеназы из пекарских дрожжей и определение ее активности.................... 95 Свойства глицеральдегидфосфатдегидрогеназы пекарских дрожжей...................... 98 Глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа (L-глицерол-З-фосфат: НАД — оксидоредуктаза, 1.1.1.8).............. . 99 Выделение, очистка и кристаллизация глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы из скелетных мышц кролика и определение ее активности.................. 100 Свойства глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы, выделенной из скелетных мышц кролика.............. 106 Лактатдегидрогеназа (L-лактат: НАД — оксидоредуктаза, 1.1.1.27)............................. 107 Выделение, очистка и кристаллизация лактатдегидрогена-зы из скелетных мышц кролика и определение ее активности........................ 108 Свойства лактатдегидрогеназы, выделенной из скелетных мышц кролика................... 112 Выделение, очистка и кристаллизация лактатдегидрогеназы из сердечной мышцы быка и определение ее активности . , ,..................... 113 Свойства лактатдегидрогеназы, выделенной из сердечной мышцы.......................... 118 Алкотольдегидрогеназа (алкоголь: НАД — оксидоредуктаза, 1.1.1.1).............................. . 120 Выделение, очистка и 'кристаллизация алкотольдегидроге- назы из печени лошади и определение ее активности . 121 Свойства алкогольдегидрогеназы, выделенной из печени лошади....................... 125 Выделение, очистка и кристаллизация алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей и определение ее активности ......................... 127 Свойства алкогольдегидрогеназы, выделенной из пекарских дрожжей.................... 130 Стр. Получение аммонийно-сульфатной фракции 52—64% насыщения из скелетных мышц кролика . . . ...,.,. . . . . . . 132 Получение аммонийно-сульфатной фракции 50—72% насыщения из скелетных мышц кролика . . . .,. •. . . . .;. . 133 Фосфоглюкомутаза (о-В-глюкозо-1,6-дифосфат: a-D-Глкжрзо-!- фосфат—фосфотрансфераза, 2.7.5.1).......... 135 Выделение, очистка и кристаллизация фосфаглкжомутазы из скелетных мышц кролика и определение ее активности ......................... 138 Свойства фосфоглюкомутазы, выделенной из скелетных мышц кролика................... 144 Гексокиназа (АТФ: D-гексозо-б-фосфотрансфераза, 2.7.1.1) . . 146 Выделение, очистка и кристаллизация гексокиназы из пекарских дрожжей и определение ее активности .... 147 Свойства гексокиназы, выделенной из пекарских дрожжей 155 Фосфофруктокиназа (АТФ: D-фруктозо-б-фосфат—1-фосфо- трансфераза, 2.7.1.11) ................. 157 Выделение и очистка фосфофруктокиназы из скелетных мышц кролика и определение ее активности...... 158 Свойства фосфофруктокиназы, выделенной из скелетных мышц кролика................... 165 Гранскетолаза (В-седогептулозо-7-фосфат: D-глицеральдегид-З- фосфат — гликоль-альдегидтрансфераза, 2.2.1.1) ..... 166 Выделение, очистка и кристаллизация транскетолазы из пекарских дрожжей и определение ее активности . . . 168 Свойства транскетолазы, выделенной из пекарских дрожжей ........................ 177 Выделение и очистка транскетолазы из печени свиньи и определение ее активности .............. 179 Свойства транскетолазы, выделенной из печени свиньи . . 186 Рибонуклеаза (рибонуклеинат — шгримидиннуклеотидо-2-транс- фераза (циклизующая), 2.7.7.16) ......... 186 Выделение, очистка и кристаллизация рибонуклеазы из •поджелудочной железы быка и определение ее активности......................... 188 Свойства рибонуклеазы, выделенной из поджелудочной железы быка.................... 196 Пируваткиназа (АТФ: пируват—фосфотрансфераза, 2.7.1.40) 197 Выделение, очистка и кристаллизация пируваткиназы из мышц кролика и определение ее активности...... 198 Свойства пируваткиназы, выделенной из скелетных мышц кролика , ..................... . . 204 Уреаза (карбамид — амидо пидролаза, 3.5.1.5)......206 Выделение и кристаллизация уреазы и определение ее активности...................... 207 Свойства уреазы.................... 209 Фруктозодифосфатальдолаза (фруктозо-1,6-дифосфат — D-гли- церальдегид-3-фосфат-лиаза, 4.1.2.13) . ........ . . . 210 Выделение, очистка и кристаллизация фруктозодифосфат-альдолазы из скелетных мышц кролика и определение ее активности Свойства фруктозодифосфатальдолазы, выделенной 211 из скелетных мышц кролика .............. 216 Фумарат-гидратаза (L-малат—гидро-лиаза, 4.2.1.2) ..... 218 Выделение, очистка и кристаллизация фумарат-гидратазы из сердца свиньи и определение ее активности..... 219 Свойства фумарат-гидратазы, выделенной из сердца свиньи 225 Глюкоэофосфатизомераза (D-глюкозо-б-фосфат—кетол-изоме- раза, 5.3.1.9) ..... :..,.,................ 227 Выделение и очистка глкжозофосфатизомеразы из скелетных мышц кролика и определение ее активности . . . 229 Свойства глюкозофосфатизомеразы, выделенной из скелетных мышц кролика...............235 Раздел IV. ФЕРМЕНТЫ КАК АНАЛИТИЧЕСКИЕ РЕАГЕНТЫ Общие представления............. i........ 237 Энзиматический метод количественного определения субстратов и никотинамищнуклеотидных коферментов......239 Энзиматический метод количественного определения пиро- виноградной кислоты................ 240 Энзиматический метод количественного определения НАДФ 243 Количественное определение НАДФ с помощью глю- козо-6-фосфат — дегидрогеназы........ . 243 Количественное определение НАДФ с помощью фос- фоглюконатдегидрогеназы ........... 244 Энзиматический метод количественного определения восстановленной формы НАД.............. 245 Энзим этический метод количественного определения НАД 246 Энзиматический метод количественного определения этанола........................ 247 Энзиматический метод количественного определения глюкозы ........................ 249 Энзиматический метод количественного определения фруктозы ........................ 250 Энзиматический метод количественного определения глю- козо-6-фосфата.................. . 252 Энзиматический метод количественного определения фрук- тозо-6-фосфата................... 253 Энзиматический метод количественного определения 6-фос- фоглюконовой кислоты................ 255 Энзиматический метод количественного определения фрук- тозодифосфата . .................. 256 Энзиматический метод количественного определения гли- церальдегид-3-фосфата............... 258 Энзиматический метод количественного определения диок- сиацетонфосфата.................. 259 Энзиматический метод количественного определения трио-зофосфатов (глицеральдегид-3-фосфата+диоксиацетон- фосфата) . ,.................... 260 Раздел V. СУЛЬФГИДРИЛЬНЫЕ ГРУППЫ ФЕРМЕНТОВ Общие представления...... . ... . ...:.. . . . . 262 Методы количественного определения сульфгидрильных групп 267 Определение сульфгидрильных групп методом амперомет- рического титрования................ 267 351 Метод определения сульфгидрильных групп по реакции с /г-хлормеркурибензоатом.................. . 286 Раздел VI. ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ СУБСТРАТОВ Получение 6-фосфоглюконовой кислоты........... 292 Метод получения фосфотриоз (эквимолекулярной смеси глицер- альдегид-3-фосфата и фосфодиоксиацетона)...... 293 Методы получения глицеральдегид-3-фосфата........ 296 Получение глицеральдегид-3-фосфата из фруктозо-1,6-ди- фосфата . „.................... 296 Получение глицеральдегид-3-фосфата из фруктозо-6-фос- фата ,....................... 298 Ферментативный метод получения пентозофосфатной смеси . . 299 Ферментативный метод получения бариевой соли глюкозо-6- фосфата (С6НпОэРВа • 7Н20)............. 305 Получение рибозо-5-фосфата................. 306 Раздел VII. НЕКОТОРЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Количественное определение фосфотриоз (глицеральдегид-3-фосфата и фосфодиоксиацетона) по легкогидролизуемому фосфору......................... 308 Методы количественного определения белка......... 309 Метод определения белка <: помощью биуретова реактива 309 Микроопределение белка с биуретовым реактивом .... 310 Определение белка по методу Лоури........ 311 Спектрофотометрический метод определения белка по поглощению в ультрафиолетовой области........ 312 Колориметрический метод количественного определения аммиака с помощью реактива Несслера............. 314 Метод определения фосфокетопентоз (рибулозо-5-фосфата и ксилулозо-5-фосфата)................... 315 Метод определения пентоз по реакции с орцином .......... 316 Метод определения седогептулозы............... 317 Метод определения неорганического, фосфора......... 319 Метод определения фруктозы и ее фосфорных производных . 320 Раздел VIII. МЕТОДЫ РАЗНЫЕ Очистка эйконогена ........ .............. 323 Приготовление натриевой щелочи, свободной от карбоната натрия......................... 323 Приготовление насыщенного раствора сульфата аммония . . . 324 Приготовление реактива Несслера .............. 325 Приготовление геля гидроокиси алюминия............ 325 Приготовление кальций-фосфатного геля . ... . . . ... . . . 327 Обработка катионитов (типа IR-120 и Дауэкс 50) и анионитов (типа IRA-400 и Дауэкс 1)............... 328 Удаление бария из бариевых солей фосфосахаров и других соединений ......'... i................i. . . ,. . 330 Номограмма для расчета числа оборотов по заданной величине g и величины g по заданному числу оборотов .... 333 Приготовление буферных растворов............. 344 Атлас кристаллических ферментов............. . 344 Цена: 150руб.
Назад	Заказ	На главную страницу