Важно подчеркнуть, что каждая молекула полимерного субстрата фактически представляет собой целый спектр субстратов (реакционных центров) с различной реакционной способностью. Это обстоятельство и отличает в первую очередь с точки зрения кинетики и механизмов реакций ферментативное превращение полимеров от превращения простых субстратов, имеющих только один реакционный центр на молекулу. При этом следует выделить два важнейших положения, определяющих закономерности ферментативной деградации полимеров. Во-первых, при деградации одной молекулы полимерного субстрата (в особенности регулярного полимера) образуется много молекул конечного продукта, что может приводить к своеобразным ' кинетическим закономерностям подобных реакций (например, в ряде случаев может наблюдаться увеличение молярной концентрации образующегося продукта при неизменной — исходного субстрата). Во-вторых, реакционная способность полимерного субстрата, как правило, убывает в ходе его ферментативной деградации. Иначе говоря, значения констант скоростей ферментативного превращения полимера прогрессивно уменьшаются по мере уменьшения степени полимеризации субстрата, что, в свою очередь, зачастую приводит к фактическому прекращению реакции при неполных степенях конверсии исходного полимера.
Помимо этого, можно выделить еще по меньшей мере три общих положения, характерных для ферментативной деградации биополимеров
1. Глубокая деструкция биополимеров происходит, как правило, под действием не отдельных ферментов, а полиферментных систем. По-видимому, нет такого «универсального» фермента, который способен был бы достаточно быстро расщепить полимер до соответствующего мономера, действуя эффективно» на всех этапах реакции. Вместо этого у ферментов — деполимераз существует определенная специализация (например, эндогликаназы, экзогликаназы, глико-гидролазы, а- и Р-ГЛИКОЗИДЗЗЫ и т. д.). Часто в состав полиферментной системы входят ферменты трех-четырех типов, и каждый тип может содержать целый ряд изоферментов. Примеры представляют целлюлазы, амилазы, ксилана-зы, хитиназы и т. д. Аналогии легко найти и у протеаз.
2. Если биополимер нерастворим, как для целлюлозы, гемицеллюлоз, хитина, многих гетерополисахаридов и т. д., то важную роль в их деструкции играет адсорбция ферментов-деполимераз на поверхности субстрата. Роль адсорбции в данном случае заключается далеко не только в концентрировании ферментов на поверхности нерастворимого субстрата, но и в резком увеличении реакционной способности фермент-субстратного комплекса. В этом состоит своеобразие субстратной специфичности деполимераз по отношению к нерастворимым биополимерам.
3. Наконец, во многих случаях растворимые продукты ферментативной деградации биополимера могут адсорбироваться на поверхности своего же исходного субстрата, практически не выходя при этом в раствор вплоть .до определенной продолжительности реакции. Это может приводить к ложным лаг-периодам реакции и соответственно к ошибочным выводам о кинетике и механизмах ферментативной деструкции полимеров.
Несмотря на важность перечисленных здесь вопросов до последнего времени как в отечественной, так и в зарубежной литературе отсутствовали монографии или учебные пособия, где рассматривались бы с общих позиций основные положения кинетики и механизмов действия ферментов и полиферментных систем на полимерные субстраты.
Попытка обобщить данный материал сделана в настоящей книге, которая представляет собой логическое продолжение первой части, опубликованной ранее отдельным томом и посвященной анализу специфичности и кинетических аспектов действия ферментов на относительно простые субстраты, такие как алифатические и ароматические спирты и альдегиды, производные карбоновых кислот, замещенные аминокислоты и их производные (не выше ди- или три-пептидов). Главное внимание в первой части книги уделялось характеру фермент-субстратных взаимодействий на достаточно ограниченных участках активного центра и кинетическим проявлениям этих взаимодействий. В основе первой части книги- лежит экспериментальный материал, полученный при изучении специфичности, кинетики и механизмов действия цинк- и кобальткарбоксипеп-тидазы, химотрипсина и трипсина из поджелудочной железы быка, алкогольде-гидрогеназ из печени человека и лошади и пенициллинамидазы бактериального происхождения. Итогом первой части книги явились обобщение и формулировка кинетико-термодинамических принципов субстратной специфичности ферментативного катализа.
Во второй части книги рассмотрены субстратная специфичность и кинетика действия ряда ферментов и полиферментных систем (в частности, лизоцима,
амилолитических и целлюлолитических ферментов) на полимерные субстраты. Анализ данного материала, наряду с выявлением характера соответствующих фермент-субстратных взаимодействий на достаточно протяженных участках активного центра, позволил в определенной степени выявить общие закономерности ферментативного превращения растворимых и нерастворимых полимерных субстратов. Для количественного анализа наблюдаемых временных закономерностей деструкции биополимеров автором совместно с коллективом сотрудников Московского государственного университета были разработаны основы кинетической теории действия последовательно-параллельных полиферментных систем.
Автор выражает глубокую признательность чл.-кор. АН СССР И. В. Березину, который привлек его внимание к проблеме специфичности ферментативного катализа и оказывал постоянную помощь и поддержку.
Автор весьма признателен своим коллегам по кафедре химической энзимо-логии МГУ М. Л. Рабиновичу, А. П. Синицыну, И. В. Чуриловой, С. Ю. Григо-раш, В. М. Черноглазову, В. Б. Герасимасу, которые внесли существенный теоретический и экспериментальный вклад в развитие нового раздела физико-химической биологии и биотехнологии — кинетики и механизмов ферментативной деструкции биополимеров. *
В основу книги положен курс лекций, который автор читает на химическом факультете МГУ студентам, аспирантам и стажерам кафедры химической энзи-мологии, а также слушателям факультета повышения квалификации. Книга будет также полезна биохимикам, энзимологам и биотехнологам, интересующимся проблемами микробиологической и ферментативной конверсии биополимеров.
Оглавление
Предисловие
Раздел А
•Общие закономерности ферментативного превращения полимерных субстратов 6
Глава первая. Ферменты-деполимеразы и их субстраты..... 6
§ 1. Некоторые понятия химии и стереохимии Сахаров и полисахаридов ............... 9
Гликозидная связь ............ Ю
Восстанавливающие концевые группы....... П
Гетерополисахариды............ 12
Гликозиды; гликон и агликон ......... ,13
Аномерные формы продуктов гидролиза...... 13
Мутаротация продуктов........... 16
§ 2. Надмолекулярная структура полисахаридов..... 17
Целлюлоза.............. 17
Ксиланы (P-1,4 и рМ,3)........... 19
Маннаны............... 20
Хитин............... 21
Амилоза............... 21
Альгиновые кислоты............ 22
§ 3. Принципы действия активных центров О-гликозид-гидролаз . 22 § 4. Кажущееся ингибирование продуктами в реакциях ферментативной деградации полимерных субстратов...... 29
Выводы................ 34
Литература ................ 35
Глава вторая. Концепция «многосайтных» активных центров и термодинамические особенности связывания и катализа деполимеразами . 37
§ 1. Картирование активных центров деполимераз. Определение понятия и основные допущения......... 37
§ 2. Подход Хироми. Теория и эксперимент...... 40
Экспериментальные примеры......... 46
1. Така-амилаза А из Aspergillus oryzae...... 46
2. а-Амилаза из Aspergillus oryzae........ 49
3. а-Амилаза из Bacillus subtilis........ 51
4. р-Амилаза из соевых бобов......... 54
5. р-Амилаза из пшеничных отрубей....... 55
6. Глюкоамилаза из Phizopus delemar....... 57
7. Эндо-1,4-р-ксиланаза из дрожжей Cryptococcus albldus .. 60 § 3. Подход Тома. Теория и эксперимент....... 62
Экспериментальные примеры......... 67
1. а-Амилаза из Bacillus amyloliquefaciens...... 67
2. а-Амилаза из Aspergillus oryzae........ 7/
214
3. Декстраназа из Streptococcus mutatis......74
Выводы.........;.......74-
Литература...............76
Глава третья. Способы ферментативной деструкции полимеров. Множественная атака..............77
§ 1. Основные понятия............ 77
? 2. Множественная атака — экспериментальные факты и альтернативная интерпретация........... 79
§ 3. Кинетическое описание эффекта множественной атаки . . 93
Модель Хироми............. 93
Модель Хутны............. 97
Выводы................. 102'
Литература............... 104
Глава четвертая. Кинетика ферментативных реакций со сложной стехиометрией (процессов деструкции полимеров)......105
j? § 1. Основные понятия............105
§ 2. Статистические подходы...........107
Кинетика действия эндодеполимеразы: взаимосвязь микроскопических и макроскопических параметров......107
?t Кинетика действия эндодеполимеразы: гидролиз, трансгликози-
Г* лирование, конденсация...........109
~ Кинетика действия экзодеполимеразы.......ПО
Кинетика действия эндодеполимеразы: влияние продуктивного
и непродуктивного связывания ......... 115
Упрощенная кинетическая модель действия эндо- и экзодепо-
лимераз...............118
Кинетика ферментативной деградации полимера: неупорядоченная и множественная атака.......' . . . 119
§ 3. Кинетика действия полиферментных систем. Статистические
подходы...............122'
§ 4. Кинетика действия полиферментных систем. Аналитические подходы ................124
Кинетический анализ полиферментного гидролиза целлюлозы
в стационарном режиме реакции........127
Кинетический анализ полиферментного гидролиза целлюлозы
в нестационарном режиме реакции........129
Выводы.................134
Литература...............136-
Раздел Б
Лизоцим. Закономерности действия и специфичность по отношению к бактериальным и модельным (природным и синтетическим) субстратам . . 138'
§ 1. Строение специфических субстратов лизоцима. Пептидогликан
бактериальной клеточной стенки ........ 139
§ 2. Ферменты, лизирующие бактерии........146
§ 3. Рентгеноструктурный анализ лизоцима. Строение активного
центра и механизм действия фермента.......150
§ 4. Сравнительное изучение структуры активного центра лизоцима
в кристалле и в растворе..........154-
Структурные «температурные» переходы лизоцима в кристалле
и растворе..............159
§ 5. Гипотеза о напряжении субстрата в активном центре лизоцима 162 § 6. Механизм ферментативного катализа лизоцимом. Современные
представления .............. 168
«Химический» механизм катализа лизоцимом.....169
«Кинетический» механизм катализа лизоцимом.....181
Цена: 150руб.
